Pagsusuri sa publiko ng data
Ang data sa mga linya ng SARS-CoV-2 at ang petsa kung kailan kinuha ang sample mula sa mga pagkakasunud-sunod na magagamit mula sa Chile ay nakuha mula sa site ng Consorcio Genomas CoV2 na magagamit sa https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Ang data ng pagbabakuna ay nakuha mula sa pampublikong datos mula sa Ministri ng Agham, Teknolohiya, Kaalaman at Innovasyon na magagamit sa https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Produkto 83).
Pagsubok sa impeksyon
Ang mga pseudotyped na virus na nagdadala ng iba't ibang mga SARS-CoV-2 na mga protina ng spike ay inihanda tulad ng nailarawan namin dati12. Sa madaling sabi, ang mga SARS-CoV-1 na nakabatay sa HIV na pseudotypes ay ginawa sa mga selula ng HEK2T sa pamamagitan ng paglilipat ng pNL293-ΔEnv-Luc kasama ang kaukulang pCDNA-SARS-CoV-4.3 Spike coding vector sa isang 2: 1 molar ratio. Ang pag-coding ng Plasmids isang spike na na-optimize ng codon na kulang sa huling 1 amino acid ng C-terminal end (SΔ19) na alam upang maiwasan ang pagpapanatili sa endoplasmic retikulum12 ay nakuha sa pamamagitan ng pagbubuo ng gene o na-customize na mutagenesis na nakadirekta sa site (GeneScript) at naglalaman ng mga sumusunod na mutasyon: ang linya ng A (sanggunian ng sanggunian), ang linya ng B (D614G), ang linya ng B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), ang linya P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) at ang linya C.37 (G75V, T76I) 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Ang bawat paghahanda sa pseudotype ay na-clear sa pamamagitan ng centrifugation sa 859 rpm sa temperatura ng kuwarto, na nabibilang sa paggamit ng HIV-3,000 Gag p1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems), na nakapaloob sa 24% fetal bovine serum (Sigma-Aldrich) at naimbak sa -50 ° C hanggang gamitin Iba't ibang dami ng mga pseudotyped na virus (tulad ng tinukoy ng mga antas ng protina ng HIV-80 p1) ay ginamit upang mahawahan ang mga cell ng HEK-ACE24 at 2 oras na ang lumipas, ang aktibidad ng firefly luciferase ay sinusukat gamit ang Luciferase Assay Reagent (Promega) sa isang Glomax 48 Microplate luminometer (Promega).
Pagsubok sa Neutralisasyon
Ang mga Pseudotyped na pagsusuri sa pag-neutralize ng virus ay ginanap nang mahalaga tulad ng nailarawan namin dati12. Sa madaling sabi, ang mga serial dilutions ng mga sample ng plasma (1: 4 hanggang 1: 8748) ay inihanda sa DMEM na may 10% fetal bovine serum at pinapalooban ng 5 ng p24 ng bawat pseudotyped na virus sa panahon ng 1 oras na 37 ° C at pagkatapos, 1 × 104 ng mga HEK-ACE2 cells ay naidagdag sa bawat balon. Ang mga cell ng HEK293T (hindi nagpapahayag ng ACE2) na incubated na may pseudotyped virus (lineage A) ay ginamit bilang isang negatibong kontrol. Ang mga cell ay lysed 48 oras mamaya, at ang aktibidad ng firefly luciferase ay sinusukat gamit ang Luciferase Assay Reagent (Promega) sa isang Glomax 96 Microplate luminometer (Promega). Ang porsyento ng neutralisasyon para sa bawat pagbabanto ay kinakalkula at ang ID50 ng bawat sample ay kinakalkula gamit ang bersyon ng GraphPad Prism 9.0.1.
Mga pagtatasa ng istatistika
Ginawa ang mga pagsusuri sa istatistika gamit ang bersyon ng GraphPad Prism na bersyon 9.1.2. Maramihang mga paghahambing ng pangkat para sa pag-neutralize ng mga titer ng antibody (NAbTs) laban sa isang panel ng mga pseudotyped na virus ng SARS-CoV-2 pati na rin ang mga paghahambing ng mga tugon ng NAbs ng katayuan sa sex at usok ay isinagawa gamit ang isang pares na naka-sign na ranggo na Wilcoxon. Ang pagbabago ng kadahilanan ay kinakalkula bilang ang pagkakaiba ng geometric na nangangahulugang titer sa ID50 kumpara sa Wild type na pseudotyped na virus. Ang pagtatasa ng ugnayan sa pagitan ng mga NAbT at edad o BMI ay isinasagawa gamit ang pagsubok ng Spearman. Ang one-way ANOVA at maraming pagsubok sa paghahambing ni Tukey ay isinagawa para sa pagsusuri ng istatistika ng infectivity. Ang isang halagang p ≤0.05 ay isinasaalang-alang bilang makabuluhan sa istatistika.
Pag-apruba ng etika
Ang protokol ng pag-aaral ay naaprubahan ng Ethics Committee ng Faculty of Medicine sa Universidad de Chile (Mga Proyekto N ° 0361-2021 at N ° 096-2020) at Clínica Santa Maria (Project N ° 132604-21). Ang lahat ng mga donor ay pumirma ng may kaalamang pahintulot, at ang kanilang mga sample ay hindi nagpapakilala.
Epekto ng spike mutations sa Lambda variant sa infectivity at pag-neutralize ng mga tugon sa mga antibodies
Isang pagsusuri ng 3695 na pagkakasunud-sunod mula sa Chile na idineposito sa GISAID bawat Hunyo 24th Ipinapakita ng 2021 ang isang malinaw na pangingibabaw ng mga pagkakaiba-iba ng SARS-CoV-2 na Gamma at Lambda sa huling accounting ng trimester, magkasama, para sa 79% ng lahat ng mga pagkakasunud-sunod.
Kapansin-pansin, ang panahong ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng isang napakalaking kampanya sa pagbabakuna kung saan 65.6% ng target na populasyon (18 taong gulang at mas matandang mga indibidwal) ang nakatanggap ng isang kumpletong pamamaraan sa pagbabakuna ayon sa Hunyo 27th 2021
Dahil sa 78.2% ng mga tao na inoculated na may isang kumpletong pamamaraan na natanggap ang hindi aktibo na bakuna ng virus na CoronaVac mula sa Sinovac Biotech, hiniling namin upang siyasatin ang epekto ng spike mutations na naroroon sa Lambda variant sa pag-neutralize ng kakayahan ng mga antibodies na na-elicit ng bakunang ito.
Para dito, nakabuo kami ng mga virus na pseudotyped na nakabatay sa HIV-1 na SARS-CoV-2 na nagdadala ng spike protein mula sa linya ng sanggunian na Wuhan-1 (Wild type; lineage A), ang mutasyon ng D614G (lineage B), at ang Alpha (lineage B .1.1.7), Gamma (lineage P.1) at Lambda (lineage C.37) na magkakaiba.
Sa panahon ng paghahanda ng virus, patuloy naming naobserbahan na ang mga cell na nahawahan ng pseudotyped na virus na nagdadala ng Lambda spike ay gumawa ng makabuluhang mas mataas na mga halaga ng bioluminescence kung ihahambing sa D614G mutant o mga variant ng Alpha at Gamma na nagpapahiwatig ng pagtaas ng impeksyon na hinimok ng Lambda spike protein
Sa Figure 1.Ang impeksyon ay namamagitan sa iba't ibang mga protina ng spike.
(A) Paglalarawan ng iskematik ng SARS-CoV-2 spike protein at ang mga variant na ginamit sa pag-aaral na ito. Ang mga linya ay ipinahiwatig sa panaklong. RBD, domain na nagbubuklod ng receptor, CM; cytoplasmic buntot.
(B) Paglalagay ng titration ng mga pseudotypes ng bawat lipi gamit ang katumbas na halaga ng HIV-1 p24. Ang aktibidad ng firefly luciferase ay sinusukat bilang kamag-anak na luminescence unit (RLU) sa 48 na oras pagkatapos ng impeksyon. Ang average at SD ay kinakalkula mula sa isang kinatawan ng eksperimento sa triplicate.
Susunod, ginamit namin ang mga pseudotyped na virus na nabanggit sa itaas upang maisagawa ang mga pagsusuri sa pag-nealis gamit ang 79 na mga sample ng plasma mula sa malulusog na mga manggagawa sa pangangalagang pangkalusugan mula sa Universidad de Chile at Clínica Santa María sa Santiago, Chile.
Ibinukod namin ang 4 na mga sample dahil hindi namin nakalkula ang isang titer ng ID50. Mula sa pinag-aralan na mga sample, 73% ay tumutugma sa mga kababaihan, panggitna edad 34 taon (IQR 29 - 43) at isang body max index (BMI) na 25 (IQR 22.7 - 27). Isang 20.5% ng mga kalahok ang nagpahayag na maging aktibong naninigarilyo habang tumatagal ang panahon ng pagbabakuna. Ang mga sample ay nakuha sa isang panggitna ng 95 araw (IQR 76 - 96) pagkatapos ng pangalawang dosis ng bakuna ng CoronaVac
Napansin namin na ang pag-neutralize ng pseudotyped na virus na nagdadala ng Wild type spike protein ay nagresulta sa isang 50% inhibitory dilution (ID50) nangangahulugang titer ng 191.46 (154.9 - 227.95, 95% CI,), habang ito ay 153.92 (115.68 - 192.16, 95% CI), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% CI), 104.57 (75.02 - 134.11, 95% CI ) at 78.75 (49.8 - 107.6, 95% CI) para sa mga pseudotyped na virus na nagdadala ng spike protein mula sa D614G mutant o ang Alpha, Gamma at Lambda na magkakaiba.
Naobserbahan din namin na ang geometric ay nangangahulugang titer ng ID50 ang mga titer ay nabawasan ng isang factor ng 3.05 (2.57 - 3.61, 95% CI) para sa pseudotyped virus na nagdadala ng Lambda spike, 2.33 (1.95 - 2.80, 95% CI) para sa Gamma spike, 2.03 (1.71 - 2.41, 95% CI) para sa Alpha spike at 1.37 (1.20 - 1.55, 95% CI) para sa D614G spike kung ihahambing sa Wild type spike.
Walang ugnayan sa pagitan ng kasarian, edad, body-mass index (BMI) o katayuan ng usok at pag-neutralize ng mga titer ng antibody na napansin sa aming pag-aaral na cohort.
Sa Figure 2.Pagsubok ng neutralisasyon gamit ang mga sample ng plasma mula sa mga bakunang CoronaVac
(A) Mga pagbabago sa katumbas na 50% na neutralization titer (ID50) sa mga sample ng plasma mula sa 75 na tatanggap ng bakunang CoronaVac laban sa D614G (lineage B), Alpha (lineage B.1.1.7),
Ang mga variant ng Gamma (lineage P.1) at Lambda (lineage C.37) kumpara sa wild-type na virus. Ang mga resulta ay ipinapakita bilang pagkakaiba sa mga titer ng pag-neutralize ng mga katugmang sample. Mga halagang P para sa paghahambing ng ID50 ay kinakalkula sa Wilcoxon sign-rank test.
(B) Ipinahiwatig ng mga plots ng kahon ang median at interquartile range (IQR) ng ID50 para sa bawat pseudotyped na virus. Ang mga pagbabago sa kadahilanan ay ipinapakita bilang pagkakaiba ng mga geometric na nangangahulugang titer sa ID50 kumpara sa mga para sa Wild type na pseudotyped na virus. Ginawa ang mga pagsusuri sa istatistika gamit ang Wilcoxon match-match na naka-sign-rank na pagsubok.
Sama-sama, isiniwalat ng aming datos na ang spike protein ng bagong kinikilalang variant ng interes na Lambda, na lubos na nagpapalipat-lipat sa mga bansang Chile at South American, ay nagdadala ng mga mutasyon na nagbibigay ng mas mataas na impeksyon at kakayahang makatakas mula sa pag-neutralize ng mga antibodies na nakuha ng CoronaVac.
